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微生態制劑：清溫豬肽對后備母豬免疫應答及抗豬圓環病毒和藍耳病毒影響的初步觀察
	文章來源：中國飼料行業信息網	更新時間：2013-03-14	點擊數：		評論本文

　　摘要目的：為探索控制動物病毒感染的新方法，觀察微生態活菌中藥發酵制劑-清溫豬泰對豬免疫應答和抗藍耳病毒(PRRSV)及豬圓環病毒(PCV-2)感染的影響，本實驗在豬場后備母豬的飼料中添加0.2%清溫豬泰，采用熒光定量PCR檢測血液中的帶毒情況，比較處理組飼喂添加清溫豬泰前后以及與對照組血液中PRRSV及PCV-2帶毒率的變化;比較清溫豬泰飼喂前后母豬體內免疫細胞CD4、IL-10基因表達水平的變化。方法：采用熒光定量PCR檢測血液中病毒相對數量和免疫細胞的CD4、IL-10基因mRNA水平的變化情況，比較清溫豬泰飼喂對動物免疫機能的影響特性。結果：后備母豬飼喂清溫豬泰后，PRRSV、PCV-2感染率明顯減少，PRRSV實驗組收到明顯的保護效果，對照組在相同環境下感染數量上升到2/5;PCV2實驗組由4/5下降到1/5，而對照組反而由1/5上升大5/5。病毒含量也顯著降低，以β-Actin為內參，實驗組PRRSV受到保護無上升，對照組含量由0.08上升到100;實驗組PCV2含量由18下降到0.7，對照組由0.88上升到48。;實驗組血液免疫細胞的CD4表達水平顯著升高，而實驗組的IL-10水平較對照組顯著降低。這顯示清溫豬泰加入飼料可顯著增強動物的免疫水平，IL-10的下降有助于改善免疫細胞控制和清除體內的病毒，提高其抗PRRSV、PCV-2感染的能力，為實際生產中防治圓環病毒病和藍耳病提供了新思路。

　　關鍵詞：微生態;中藥;益生素;發酵;活菌;清溫豬泰;PRRSV;PCV-2;后備母豬;CD4;IL-10;基因表達;熒光定量PCR

　　前言

　　近年廣泛流行的免疫抑制病，如豬呼吸與繁殖綜合征(PRRS)和豬圓環病毒(PCV-2)引起的仔豬斷奶后多系統衰竭綜合征(Post-weaning multisystemie wasting syndrome，PMWS)等病，對我國養豬業造成了極嚴重損害，豬群生產性能下降，母豬流產增多。特別是產房及保育仔豬大量發病及死亡，損失極為慘重。2008年及2010年下半年豬肉價格攀升，國內CPI指數不斷提升，目前已被公認與豬只疫病暴發，死亡過多，供應失調密切相關。健康豬群中的高帶毒率不僅影響豬的生長發育和增重，也是疫病暴發的基礎。目前動物疫病肆虐，飼養和疾病防治中抗生素濫用涉及食品安全的問題更為人們深切關注。

　　在動物感染PRRSV和PCV2的過程中，IL-10基因和CD4基因表現出顯著的改變，兩種病毒對動物的免疫應答調控和關鍵的Th 細胞分化和生長均有抑制。Sipos等對PMWS感染豬的細胞因子mRNA及蛋白質水平進行研究發現，其外周淋巴細胞中IL-10表達水平很高，表明IL-10的過量表達可能引起免疫反應向對機體不利的方向發展。J.Nielsen等用PCV2攻毒3周齡仔豬，14～21天后出現PMWS臨床癥狀的仔豬有明顯的淋巴細胞減少征，而未出現癥狀的感染豬及陰性對照豬淋巴細胞無明顯變化，動力學分析發現其CD3+淋巴細胞均有明顯的減少;PCV2攻毒豬的T淋巴細胞亞群也有變化，CD3/C4/CD8 三聯標簽檢測，CD3+CD4+cD8+記憶/激活細胞的含量明顯下降。因此，降低IL-10基因表達水平或維持IL-10基因在低水平表達對動物抗病毒免疫應答和機體健康有重要意義。CD4基因表達水平與陽性Th免疫細胞數量的比例成正相關，對促進機體抗病毒免疫功能，提高抗病抵抗力具有推動作用。

　　在動物免疫應答過程中，作為非特異免疫調控的重要組成和有直接殺菌、抗病毒效果的活菌中藥發酵制劑在近年來發揮出突出的效果和貢獻�；罹兴幇l酵制劑是指選取優質中藥利用活性乳酸菌進行發酵來達到提高功效的作用。

　　活菌中藥發酵的五大革命：

　　1、中藥成分經過益生菌轉化，由大分子變成小分子，100%被機體吸收。

　　2、真正的療效提速，30分鐘吸收到達血液。

　　3、真正的藥效提高，發酵中藥比傳統中藥提高4-28倍。

　　4、發酵過程分解毒性，真正無毒副作用。“是藥三分毒”成為歷史。

　　5、改善中藥口味，使“良藥不再苦口”

　　在豬場飼料中添加清溫豬肽展現了優異的效果，如母豬產仔率提高、死胎率下降, 特別對保育期仔豬具有明顯增重效應, 臨床對僵弱仔豬的生長改觀;促使我們對本動物進行實驗，觀察其對豬體內PCV-2和PRRSV帶毒率的影響。通過實驗，我們找到了一種新型、經濟、高效的預防和治療豬感染PCV2和PRRSV的新途徑。

　　1. 實驗材料

　　1.1 清溫豬肽

　　活菌中藥發酵制劑，由哈爾濱中科生物工程有限公司提供的商品化制劑，商品名為清溫豬肽。

　　1.2 實驗豬

　　后備母豬對比實驗：180日齡加系后備母豬10頭，體重90-100公斤，由江蘇省徐州市某原種豬場提供和飼養管理, 分為實驗組5頭和對照組5頭，實驗組飼料中添加0.2%清溫豬肽，除此之外兩組所用基礎飼料一致，飼養管理條件相同。實驗母豬開始前和開始飼喂添加清溫豬肽飼料后10、20天，各自采抗凝血5ml，分析血中PCV-2，PRRSV的變化。

　　1.3實驗試劑

　　RNA提�。篢IANGEN TRNzol 總RNA提取試劑盒，RNAprep pure血液總RNA提取試劑盒(天跟生化科技有限公司，北京)，氯仿(分析純)，異丙醇(分析純);反轉錄：TIANGEN Quant cDNA第一鏈合成試劑盒(天跟生化科技有限公司，北京);熒光定量PCR: TIANGEN Quant qRT-PCR(SYBR Green)Kit，RealMasterMix(SYBR Green) (天跟生化科技有限公司，北京);引物合成：上海英俊生物技術公司。

　　2.實驗方法

　　2.1 實驗時間和飼養管理

　　實驗時間：2011年10月21日至2011年11月13日期間，具體采血時間為飼喂開始點前采血、飼喂后10天以及飼喂后20天采血。

　　實驗組后備母豬的飼養管理、飼養環境、免疫程序與對照組完全相同。均采用標準化豬場管理流程。

　　2.2 實時定量RT-PCR檢測母豬的體內PCV-2、PRRSV，IL10 基因、CD4基因的變化

　　通過對PCV2病毒DNA和PRRSV病毒RNA的提取、反轉錄采用天根公司反轉錄試劑盒。定量檢測用相對定量方法，試劑盒采用天根公司Q-PCR試劑盒。對血漿中全細胞的mRNA的提取來檢測IL10 基因、CD4基因的變化。

　　(引物設計參考PRIMER 5.0,Blast：NCBI)

　　表1 病毒檢測引物：PRRSV PCR產物長度為217bp, PCV PCR產物長度為145bp